以下是原鑫生物整理的短鏈脂肪酸ELISA試劑盒的完整使用指南，整合操作流程、樣本處理、結(jié)果計(jì)算及關(guān)鍵注意事項(xiàng)。

 一、試劑盒組成與原理  

1. 核心組分（依據(jù)）：  

    預(yù)包被96孔酶標(biāo)板（短鏈脂肪酸特異性抗體）  

    凍干標(biāo)準(zhǔn)品（濃度梯度）  

    生物素標(biāo)記抗體工作液  

    酶標(biāo)記物工作液（HRP鏈霉親和素）  

    TMB顯色底物（A/B液需1:1混合）  

    終止液（2M硫酸，具腐蝕性）  

    30×濃縮洗滌液（需稀釋至25倍）  

    樣本稀釋液  

   > 檢測(cè)原理：雙抗體夾心法。樣本中短鏈脂肪酸與包被抗體結(jié)合，再與酶標(biāo)記物形成復(fù)合物，催化底物顯色，OD450nm值與濃度正相關(guān)。   

 二、樣本處理規(guī)范  

 關(guān)鍵步驟：  

| 樣本類(lèi)型 | 處理步驟 | 保存條件 

| 血清     | 全血室溫靜置2h或4℃過(guò)夜 → 1000×g離心20min取上清 | 20℃（≤6個(gè)月）或80℃（≤2年） 

| 血漿     | 推薦EDTA抗凝 → 采血30min內(nèi)4℃、1000×g離心15min | 同血清 

| 組織勻漿 | 1. PBS洗滌 → 稱(chēng)重；<br>2. 冰上裂解（1g組織+9ml裂解液）→ 超聲/凍融破碎；<br>3. 500010000×g離心10min取上清；<br>4. 測(cè)總蛋白（BCA法），調(diào)至13mg/ml | 同血清 

| 細(xì)胞上清 | 2500rpm離心5min取澄清上清 | 80℃凍存 

| 糞便     | 新鮮采集或80℃保存，稀釋后離心取上清（需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證） | 80℃ 

> 裂解液選擇：  

>  避免含NP40、Triton X100、DTT的RIPA（抑制反應(yīng)）；  

>  推薦50mM Tris + 0.9% NaCl + 0.1% SDS (pH7.3) 。  

> 特殊處理：肝臟/腎臟/胰腺樣本需1% H?O?滅活15min（防內(nèi)源性過(guò)氧化物酶假陽(yáng)性）。  

 三、操作流程  

 1. 試劑準(zhǔn)備  

 洗滌液：30ml濃縮液 + 720ml超純水 → 稀釋25倍（若結(jié)晶需40℃水浴溶解）。  

 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋?zhuān)?nbsp; 

   復(fù)溶：1ml樣品稀釋液溶解凍干標(biāo)準(zhǔn)品 → 渦旋混勻 → 1000×g離心1min ；  

   稀釋?zhuān)喝?管各加300μl稀釋液 → 按1:2等比稀釋?zhuān)ㄈ?00μl原液→1/2管→混勻→取300μl→1/4管…）。  

 生物素抗體工作液：按1:100現(xiàn)配（10μl濃縮液 + 990μl抗體稀釋液）。  

 2. 檢測(cè)步驟  

| 順序 | 操作 | 參數(shù) 

| 預(yù)洗 | 酶標(biāo)板加洗滌液 → 靜置30s → 棄液（重復(fù)2次） | 拍干殘留液 

| 加樣 | 標(biāo)準(zhǔn)品/樣本各50μl → 立即加50μl生物素抗體 | 更換吸頭，混勻1min 

| 孵育1 | 覆膜 → 37℃孵育45min → 洗板3次 | 每次浸泡1min 

| 加酶 | 每孔加100μl酶標(biāo)物工作液 → 覆膜 → 37℃孵育30min | 洗板5次 

| 顯色 | 加90μl TMB底物 → 37℃避光顯色1020min（密切監(jiān)控） | 顯藍(lán)色梯度 

| 終止 | 加50μl終止液 → 立即測(cè)OD值（顏色轉(zhuǎn)黃） | 15min內(nèi)完成 

 四、結(jié)果計(jì)算與驗(yàn)證  

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：  

    橫坐標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度（如2000~31.25 pg/ml）；縱坐標(biāo)：平均OD450nm值（復(fù)孔）；  

    推薦四參數(shù)擬合（4PL） ：避免線(xiàn)性/半對(duì)數(shù)法的低值壓縮誤差（用Curve Expert或酶標(biāo)儀自帶軟件）。  

2. 濃度計(jì)算：  

    樣本OD值代入曲線(xiàn)方程 → 濃度 × 稀釋倍數(shù)；  

    校正讀數(shù)：若酶標(biāo)儀支持，用OD450nm  OD570nm/630nm消除背景干擾。  

 五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)  

1. 樣本處理：  

    避免溶血/脂血樣本；  

    組織勻漿離心后上清若渾濁，需二次離心或過(guò)濾。  

2. 操作細(xì)節(jié)：  

    全程更換吸頭，分設(shè)試劑移液槽（防交叉污染）；  

    顯色時(shí)間嚴(yán)格控制在20min內(nèi)（過(guò)度顯色導(dǎo)致假陽(yáng)性）；  

    洗板后充分拍干，防止殘留液體稀釋試劑。  

3. 試劑保存：  

    未開(kāi)封試劑盒：20℃；開(kāi)封后酶標(biāo)板28℃干燥保存，其他組分按說(shuō)明；  

    終止液（2M硫酸）按危險(xiǎn)廢棄物處理。  

4. 質(zhì)控要求：  

    批內(nèi)/批間變異系數(shù)需＜10%/15%；  

    標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2 ≥ 0.99。  

 六、常見(jiàn)問(wèn)題解決  

 顯色異常：  

   無(wú)色/弱色：檢查酶標(biāo)物活性、孵育溫度；  

   全板深藍(lán)色：洗板不充分或樣本濃度過(guò)高（需稀釋?zhuān)?nbsp; 

 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性差：復(fù)溶不徹底或梯度稀釋操作誤差（渦旋混勻+離心）。  

> 附：流程圖摘要  

> 樣本處理 → 試劑平衡 → 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 → 加樣孵育 → 顯色終止 → 讀數(shù)計(jì)算  

請(qǐng)以實(shí)際短鏈脂肪酸ELISA試劑盒包裝內(nèi)說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)，操作前務(wù)必閱讀廠商提供的詳細(xì)指南。